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環(huán)形細胞侵襲實驗--使細胞侵襲的過程可視化

  

腫瘤細胞的侵襲能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個重要特征。為了研究腫瘤細胞侵襲過程的機制,一系列體外細胞實驗建立起來,用于研究細胞侵襲基底膜和基質(zhì)的過程。體外侵襲實驗首先是采用人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel,可以在37℃逐漸凝固成膠,結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。通常的實驗是在孔徑8μm的濾膜上鋪上一層Matrigel,細胞不能自由穿過,必須分泌水解酶,并通過變形運動才能穿過。實驗之后通過對穿過“基質(zhì)膜”的細胞進行計數(shù),來確定細胞的侵襲能力。這一方法非常仿真的模擬了細胞在生理狀態(tài)下的侵襲過程,但是其也有一定的局限性。由于濾膜的不透光性,使得直接觀察細胞偽足和骨架變化變得非常困難。
 
英國的科研人員改進了腫瘤侵襲實驗,設(shè)計了一種環(huán)形細胞侵襲實驗,使得操作進一步簡化,并且也能模擬3D侵襲。重要的是,能夠使侵襲過程中的活細胞或者是固定的細胞可視化。借用這個實驗方法,研究人員發(fā)現(xiàn)侵襲過程中主要有蛋白酶參與其中。研究發(fā)現(xiàn),在3D侵襲的細胞中蛋白酶會聚集在偽足和細胞的粘附點上。
 
Cells Assemble Invadopodia-Like Structures and Invade into Matrigel in a Matrix Metalloprotease Dependent Manner in the Circular Invasion Assay
X. Yu and L. M. Machesky
PLoS ONE, 2012, 10.1371/journal.pone.0030605
 
 
(一)實驗材料
1) 細胞:   MDA-MB-231
2) 實驗耗材:  傷口愈合插件         (ibidi,80209
               玻璃底培養(yǎng)皿      (ibidi81158 
3) 試劑:    Matrigel           BD
             4%多聚甲醛溶液
             0.1%Triton X-100
 
(二)實驗步驟
ibidi傷口愈合插件放入ibidi玻璃底培養(yǎng)皿中間
在插件外部鋪 6 × 10MDA-MB-231細胞,等待細胞貼壁
細胞貼壁后移除傷口愈合插件,在細胞中心形成一個0.8cm2的空白區(qū)域
加入250μl50% BD Matrigel 4.5mg/ml),將培養(yǎng)皿內(nèi)層剛好鋪滿,能形成一個0.8mm厚度的“基質(zhì)膜”
孵育2小時,使Matrigel完全固化,加入培養(yǎng)基
37。C培養(yǎng)箱中孵育24小時。
4%多聚甲醛溶液固定30分鐘,并以 0.1%Triton X-100通透30分鐘后可以加入DAPI或者抗體染色
 
 
(三)實驗結(jié)果
 
 
1、使用環(huán)形細胞侵襲實驗?zāi)軌蛴^測到細胞侵襲中的活動(圖一)
 
圖1.jpg 
 
圖一:MDA-MB-231細胞在環(huán)形細胞侵襲過程中形成了侵襲鏈:AMDA-MB-231細胞在matrigel中形成了一個長的侵襲鏈 B)勤洗臉的免疫熒光圖,紅色為Actin,藍色為細胞核
 
 
2. 使用環(huán)形侵襲實驗?zāi)軌蛴涗泴Ρ惹忠u速率和侵襲面積(圖二)
 
圖2.jpg 
 
圖二:MDA-MB-231細胞侵襲過程受MMP調(diào)控。加入25μMGM6001能顯著的減緩侵襲速率和侵襲面積。

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